TUGAS REKGEN jurnal tanaman transgenik
Analisis Molekuler Gen Partenokarpi DefH9-RI-iaaM
pada Progeni Tomat Transgenik
(Molecular Anaysis of DefH9-RI-iaaM Parthenocarpic
Gene in Transgenic Tomato Progenies)
Metode yang digunakan dalam penelitian
tersebut yaitu:
1.
Analisis Molekuler, Uji Ekspresi, dan Uji Fenotipik
Gen DefH9-RI-iaaM pada
Galur Tomat Transgenik T1
Pengambilan sampel dilakukan
dengan mengambil daun muda tanaman untuk analisis molekuler. Dari tiap galur
tomat transgenik T1 di-sampling sebanyak 10 tanaman untuk analisis molekuler.
2.
Analisis molekuler gen DefH9-RI-iaaM pada galur T1
Analisis molekuler
dilakukan dengan teknik PCR menggunakan metode Wang et al. (2008). Teknik ini
dilakukan dengan tujuan mendeteksi keberadaan gen DefH9-R1-iaaM pada sampel
tiga galur tomat transgenik
Ekstraksi DNA dilakukan
berdasarkan protokol Extract-N-AmpTM Plant PCR Kit (Invitrogen™) yang terdiri
atas extraction solution dan dilution solution.
Sampel daun dipotong
dengan menggunakan paper punch berdiameter 0,5 cm, lalu dimasukkan ke dalam
tabung mikro 1,5 ml yang berisi 100 µl extraction solution, kemudian diinkubasi
di dalam waterbath incubator dengan suhu 95°C selama 10 menit. Selanjutnya,
sampel diinkubasi pada suhu ruang hingga dingin, kemudian ditambah dengan 100
µl dilution solution. Sampel DNA yang diperoleh selanjutnya diambil sedikit untuk
proses PCR dan sisanya disimpan di dalam freezer -20°C sebagai cadangan.
Sampel DNA selanjutnya
diamplifikasi menggunakan mesin Peltier Thermal Cycler PTC-100TM (MJ Research).
Reaksi PCR terdiri atas 4 µl DNA genom sebagai cetakan (template), 10 µl RED
Extract-N-AmpTM PCR Reaction Mix, 0,4 µl primer IAAM 5, 0,4 µl IAAM 3, dan
ditambah akuades steril sampai dengan volume 20 µl. Template yang digunakan
dalam reaksi PCR adalah DNA genom yang diisolasi dari daun tanaman tomat
transgenik, varietas Oval dan CL 6046 nontransgenik (kontrol negatif), serta
DNA plasmid A. tumefaciens yang memiliki insersi gen partenokarpi DefH9-iaaM
(kontrol positif). Kondisi optimal reaksi PCR, yaitu tahap denaturasi awal 95°C
selama 5 menit, dilanjutkan dengan denaturasi pada suhu 95°C selama 15 detik,
proses annealing pada suhu 60°C selama 30 detik, serta polimerisasi pada suhu
72°C selama 1 menit. Proses denaturasi, annealing, dan polimerisasi tersebut
dilakukan secara berulang sebanyak 40 siklus. Tahap akhir amplifikasi diperpanjang
dengan inkubasi pada suhu 15°C selama 60 menit, kemudian dilanjutkan pada suhu
4°C selama 15 menit.
Fragmen DNA hasil
amplifikasi kemudian dielektroforesis menggunakan gel agarosa 1%. Setiap sampel
DNA, kontrol positif, kontrol negatif, dan marka DNA ladder 1 kb ditambah 2 µl
loading dye 10× dan dimasukkan ke dalam sumur gel agarosa, lalu elektroforesis
dijalankan dengan tegangan listrik tetap 80 V selama 60 menit hingga migrasi
loading buffer sejauh 70% dari panjang gel. Gel agarosa kemudian
divisualisasikan dengan mesin ChemiDoc™ (Bio-Rad) yang memiliki program QuantityOne®.
Hasil positif
amplifikasi DNA menghasilkan pita berukuran 158 bp.
3.
Uji ekspresi gen DefH9-RI-iaaM pada galur T1
Untuk uji ekspresi
DefH9-RI-iaaM, dari setiap galur tomat hanya dipilih satu tanaman tomat T1 yang
positif membawa gen tersebut. Uji ekspresi menggunakan teknik real-time PCR
dengan sampel berupa mRNA yang diisolasi dari kuncup bunga tomat sekitar 200 mg
(2–3 kuncup bunga). Hal ini dilakukan karena gen DefH9-RI-iaaM oleh promotor
DefH9 hanya diekspresikan pada bagian ovulum dan plasenta bunga.
Tahapan uji ekspresi
gen DefH9-RI-iaaM meliputi isolasi mRNA, sintesis cDNA, real-time PCR, dan
analisis data.
Tahapan isolasi mRNA dimulai dengan
memasukkan sampel kuncup bunga dari setiap galur tomat ke dalam larutan
nitrogen cair untuk menghentikan proses metabolisme sel. Isolasi mRNA tomat
dilakukan menggunakan protokol dari Dynabeads® mRNA DIRECT™ Micro Kit.
Selanjutnya, mRNA yang diperoleh dijadikan template untuk sintesis cDNA.
Sintesis cDNA dilakukan
dengan metode one step menggunakan SYBR® Green Reaction Kit (Invitrogen™)
dengan primer spesifik untuk gen DefH9-RI-iaaM, yaitu primer IAAM 5 dan IAAM 3.
Proses sintesis cDNA berlangsung secara otomatis di dalam mesin real-time PCR.
Mesin di program untuk sintesis cDNA sebagai berikut. Tahap aktivasi dengan
suhu 50°C selama 3 menit, denaturasi pada suhu 95°C selama 5 menit, amplifikasi
sebanyak 40 siklus pada suhu 95°C selama 15 detik, kemudian 60°C selama 30
detik, dan tahap akhir amplifikasi pada suhu 40°C selama 1 menit.
Ekspresi gen
DefH9-RI-iaaM dapat dianalisis berdasarkan saat munculnya sinyal amplikon pada
grafik hasil real-time PCR.
4.
Uji fenotipik partenokarpi pada galur T
Uji fenotipik
dimaksudkan untuk mengetahui ekspresi DefH9-RI-iaaM secara fenotipik dengan
mengamati karakter partenokarpi pada galur tomat transgenik T1. Lima tanaman
terbaik sebagai ulangan dipilih untuk setiap galur sebagai bahan pengujian
fenotipik. Percobaan dilakukan dengan Rancangan Acak Kelompok Lengkap
(Randomized Complete Block Design/RCBD). Sebagai kontrol digunakan varietas
Oval (nontransgenik). Pengamatan dan pengambilan data dilakukan setiap minggu
dengan peubah jumlah bunga per tanaman, jumlah buah per tanaman, sedangkan
jumlah biji dan berat buah segar diambil setiap panen (lima kali panen). Data
yang diperoleh selanjutnya dianalisis ragam ANOVA dengan taraf kepercayaan 95%.
5.
Analisis Molekuler Gen DefH9-RI-iaaM pada Galur Tomat Transgenik T2
Prosedur analisis galur
tomat transgenik T2 sama dengan analisis galur T1. Sebanyak 10 tanaman per
galur generasi T2 dipilih untuk analisis molekuler. Pengambilan sampel daun
dilakukan pada saat tanaman berumur 4–5 minggu setelah tanam. Foto visualisasi
sampel DNA hasil elektroforesis gel diamati dan dianalisis berdasarkan ada
tidaknya pita DNA berukuran 158 bp.
6.
Analisis Molekuler Gen DefH9-RI-iaaM pada Galur
Tomat Transgenik T3
Prosedur analisis galur
tomat transgenik T3 sama dengan analisis galur T1 dan T2. Sebanyak 10 tanaman per
galur generasi T3 dipilih untuk analisis molekuler. Pengambilan sampel daun
dilakukan pada saat tanaman berumur 4–5 minggu setelah tanam. Foto visualisasi
sampel DNA hasil elektroforesis gel diamati dan dianalisis berdasarkan ada
tidaknya pita DNA berukuran 158 bp
cr: Nanda dwi martina dan Siti apriliyanti k. (bio b)
Komentar
Posting Komentar